К созданию миланской росписи Леонардо тщательно и долго готовился. Он выполнил множество набросков, в которых уточнял позы и жесты отдельных фигур. «Тайная вечеря» привлекла его возможностью развернуть перед зрителем человеческую драму, показать различные характеры, вскрыть душевный мир человека, обрисовать его переживания. Художник воспринял «Тайную вечерю» как сцену предательства, внеся в традиционное изображение легенды драматическое начало, благодаря чему картина приобрела совсем новое звучание.
«Тайная вечеря» — одно из самых зрелых и законченных произведений Леонардо. Мастер здесь избегает всего того, что могло бы затемнить основное в изображённом им действии. В центре он помещает фигуру Христа, выделяющуюся в просвете двери. Апостолов он сознательно отодвигает от Христа, чтобы ещё более подчеркнуть его место в композиции. Учеников Леонардо разбивает на четыре симметрические группы, полные жизни и движения. Стол он делает небольшим, а трапезную — пуритански строгой и простой. Это даёт возможность сосредоточить внимание зрителя на фигурах. Во всех таких приёмах сказывается глубокая сознательность творческого замысла, в котором всё взвешено и учтено.
Основной задачей, которую поставил себе Леонардо в «Тайной вечере», была реалистическая передача сложнейших психологических реакций учеников на слова Христа: «Один из вас предаст меня». Придав апостолам законченные характеристики, Леонардо заставляет каждого из них по-своему реагировать на произнесённые слова. Именно эта тонкая психологическая дифференциация, основанная на разнообразии лиц и жестов, и поражала сильнее всего современников Леонардо в его росписи, особенно при сопоставлении последней с более ранними флорентийскими изображениями на эту же тему. То, что Леонардо каждого из учеников трактует индивидуально, было тонко подмечено выдающимся русским художником Александром Ивановым, писавшим: «Разнообразие впечатлений, произведённых словами Иисуса на апостолов, выражено самым совершеннейшим образом».
Подобно брошенному в воду камню, порождающему всё более широко расходящиеся по поверхности круги, слова Христа, упавшие среди мёртвой тишины, вызывают движение в собрании, за минуту до того пребывавшем в состоянии полного покоя. Особенно бурно откликаются на слова Христа три апостола, которые сидят по его левую руку.
Группа, расположенная с другой стороны от Христа и отдалённая от него значительным интервалом, отличается несравненно большей сдержанностью жестов. Представленный чуть отвернувшимся, Иуда судорожно сжимает кошель с серебренниками и со страхом смотрит на Христа; его затенённый, уродливый, грубый профиль контрастно противопоставлен ярко освещенному прекрасному лицу Иоанна, безвольно опустившего голову на плечо и сложившего руки на столе. Между Иудой и Иоанном — голова Петра; наклонившись к Иоанну и опершись левой рукой о его плечо, он что-то шепчет ему на ухо, в то время как его правая рука решительно схватилась за меч, чтобы защитить Учителя...
